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一、siRNA和shRNA的区别

1. 结构与组成

siRNA（小干扰RNA）：siRNA是双链RNA，长度通常为20-25个碱基对，两端有2个碱基的3'突出端，由两条互补的RNA链组成，一条为正义链（与目标mRNA同源），另一条为反义链（与目标mRNA互补），siRNA通常由外源性或内源性双链RNA经Dicer酶切割产生。

shRNA（短发夹RNA）：shRNA是单链RNA，能够形成发夹结构（stem-loop结构），包含一个短的双链区域（19-29 bp）和一个环状区域（loop），它由正义链、环状序列和反义链组成，整体呈现发夹形状，shRNA通过基因工程手段构建到表达载体中，转录后形成发夹结构。

2. 作用机制

siRNA：siRNA被Dicer酶切割后，直接与RNA诱导沉默复合体（RISC）结合，siRNA的反义链引导RISC识别并切割与siRNA互补的目标mRNA，导致mRNA降解。

shRNA：shRNA由表达载体转录产生后，被Dicer酶切割成siRNA，再进入RISC发挥作用，shRNA首先形成发夹结构，然后被加工成siRNA，最终降解目标mRNA。

3. 应用方式

siRNA：siRNA通常以化学合成或体外转录的方式获得，直接转染细胞，适用于短期实验，siRNA转染后数小时内即可发挥作用，但效果持续时间较短（通常为几天）。

shRNA：shRNA通过病毒载体（如慢病毒、腺病毒）或质粒载体导入细胞，整合到基因组中，实现长期表达，shRNA在细胞内持续转录，产生siRNA，适用于长期实验或建立稳定细胞系。

4. 优缺点

siRNA

优点：操作简便，适用于快速筛选；可避免基因组整合带来的潜在风险。

缺点：干扰效果持续时间短，需反复转染；化学合成成本较高。

shRNA

优点：可实现长期、稳定的基因沉默；适用于体内实验和动物模型。

缺点：载体构建和病毒包装过程复杂；存在基因组整合风险，可能引发插入突变。

二、常规干扰检测的分组设置

在进行RNA干扰实验时，合理的分组设置是确保实验结果可靠性的关键。以下是常规干扰检测的分组建议：

1. 实验组

转染针对目标基因的特异性siRNA或shRNA。

可设置不同浓度或时间点，观察干扰效果。

2. 对照组

阴性对照组（Negative Control, NC）

转染与目标基因无同源性的非特异性siRNA或shRNA。

用于排除非特异性干扰效应。

空白对照组（Mock）

不转染任何RNA或载体，仅加入转染试剂。

用于评估转染试剂对细胞的影响。

3. 阳性对照组（可选）

已知有效干扰组

转染针对已知易干扰基因的siRNA或shRNA。

用于验证实验体系和转染效率。

4. 分组设置总结

实验组用于验证对目标基因的干扰效果。

阴性对照组用于排除非特异性干扰。

空白对照组用于评估转染试剂的影响。

阳性对照组（可选）用于验证实验体系有效性。

5. 注意事项

重复实验：每组至少设置3个生物学重复，减少实验误差。

检测指标：

mRNA水平：通过qRT-PCR检测目标基因的mRNA表达量。

蛋白水平：通过Western blot或ELISA检测目标蛋白的表达量。

表型变化：观察细胞增殖、凋亡、迁移等表型变化。

时间点设置：根据基因表达周期和实验目的，设置多个时间点（如24小时、48小时、72小时）。

三、总结

siRNA与shRNA的区别：

siRNA是双链RNA，直接发挥作用；shRNA是单链RNA，形成发夹结构后被加工成siRNA。

siRNA适用于瞬时干扰，shRNA适用于稳定干扰。

分组设置：

必须设置实验组、阴性对照组和空白对照组，必要时可增加阳性对照组。

通过多时间点和多重复实验，确保结果的可靠性和可重复性。

通过合理的分组设置和科学的实验设计，可以有效验证RNA干扰的效果，为后续研究提供可靠依据。

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