CAR T的长期存在与其临床治疗效果紧密相关，长寿命记忆性CAR T提供持续免疫监视阻止肿瘤复发【1,2】。模式动物研究发现，非对称分裂（asymmetric cell division，ACD）是CD8+T细胞记忆形成的重要机制之一【3,4】。亲代细胞分裂而来的靠近抗原提呈细胞（antigen-presentation cells，APCs）的子细胞继承免疫突触，更可能分化为短寿命效应T细胞（effector T cell，Teff），相反，远端子细胞则分化为具有独特转录、表观和代谢特征的长寿命记忆性T细胞（详见BioArt报道：专家点评Nature | 郭傲/黄宏龄/迟洪波/ Douglas Green等发现改良T细胞功能的表观遗传学策略）【4-6】。鉴于CAR T对于肿瘤治疗的广阔前景，在过去十年里，研究人员始终对CAR T的表型和记忆形成保持浓厚的兴趣。但是，长寿命和短寿命CAR T发育的细胞机制，尤其是ACD是否参与其中，仍然不清楚。
近日，美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院Christoph T. Ellebrecht研究团队在Nature杂志在线发表题为Fate induction in CD8 CAR T cells through asymmetric cell division的研究文章。该研究通过scRNA-seq、LIPSTIC、流式和代谢分析，揭示非对称分裂导致CAR T细胞的不同命运抉择，为进一步理解CAR T分化和改善治疗提供新的视角。

团队首先使用分选酶标记细胞间接触标记免疫搭档（labelling immune partnerships by sor-tagging intercellular contacts，LIPSTIC）标记技术示踪CAR T亲代细胞经APCs刺激首次分裂后的远端和近端子代细胞（详见BioArt报道：Nature | uLIPSTIC：记录体内免疫细胞互作的通用方法）。流式检测发现子代细胞具有相等的LIPSTIC+（靶细胞近端子代）和LIPSTIC-（靶细胞远端子代）细胞群，表明CAR T第一次分裂存在ACD行为。特征分析表明，相比于LIPSTIC-细胞群，LIPSTIC+细胞体积更大、CD25表达更多、增殖能力更强。与此同时，代谢分析表明LIPSTIC+细胞依赖糖酵解代谢而LIPSTIC-细胞群主要依赖线粒体氧化磷酸化。随后，作者在CD4和CD8来源以及初始（naïve，CD62L+CD45RO-）、效应（CD62L-）来源CAR T以及第一次分裂之后子代CAR T细胞再次靶细胞暴露后的分裂均发现类似的ACD现象。总之，这些数据表明CAR T激活后采取非对称分裂方式，而LIPSTIC+代表APCs近端子代，LIPSTIC-代表APCs远端子代细胞群，且子代再次靶细胞暴露仍然存在ACD。

之后，作者将分选的近端子代LIPSTIC+和远端子代LIPSTIC-CAR T细胞过继入NOD-scid-gamma（NSG）小鼠并再次注入Nalm6白血病细胞，30天后发现接受远端子代细胞的小鼠外周血中有更多的T细胞且白血病进展得到有效控制，表明远端子代细胞在体内的持续时间更长且肿瘤控制效果更好。同时，作者在体外检测首次分裂子代细胞的杀伤毒性。结果表明分裂后第一天远端子代细胞和近端子代细胞具有相似的杀伤能力，而在第四天培养后，远端子代细胞的杀伤能力低于近端子代细胞，表明靶细胞激活迅速诱导近端和远端子代细胞的杀伤能力，尽管远端子代细胞在活化和代谢方面较低但其寿命更长。

紧接着，作者分离静息、活化后分裂前以及活化后第一次分裂的子代CAR T细胞行单细胞蛋白质组、转录组和TCR测序分析。首先，基于膜表面测序数据的UMAP分析表明静息CAR T和活化CAR T显著分离，表明活化诱导CAR T膜表面蛋白谱的变化；而分裂子代细胞位于静息和活化细胞之间，且远端和近端子代细胞同样分开，表明活化细胞ACD导致子代细胞膜表面蛋白谱的不同。具体来说，近端子代细胞继承活化未分裂亲代细胞的膜蛋白表达模式，而远端子代细胞则更类似于静息细胞。转录组分析表明远端和近端子代细胞具有不同的转录组特征。具体来说，相比于初始T细胞样近端子代细胞，远端子代细胞高表达LEF1、TCF7、CCR7、IL7R和KLF2，而近端子代细胞则高表达MYC和MTORC1靶基因，与之前近端细胞依赖糖酵解代谢一致。那么，是什么原因导致的转录组不同？是ACD导致的预先存在RNA的不均分配还是ACD之后命运相关基因转录的上调和下调？RNA速率分析证实这两种情况同时驱动ACD后的转录组差异。

最后，作者使用pySCENIC分析不同细胞间转录因子相关基因网络或调控子（regulon）。结果表明近端子代细胞上调的调控子与凋亡、增殖和效应细胞分化相关，包括TP73、E2F2/7/8、MYBL1和YBX1；而远端子代细胞上调的调控子与自我更新和抗增殖相关，包括IRF1、STAT1、KDM5B、REST、FLI1、MXD4和IKZF1。鉴于IKZF1在限制T细胞增殖、效应分化和活化的作用且与ACD无关，作者接下来进一步研究IKZF1对远端子代细胞命运的影响。经CRISPR-Cas9介导IKZF1敲除后，远端子代细胞表现出类似于近端子代细胞的表型，包括CD45RA表达降低和增加的效应分化。体内实验同样表明，相比于对照组，IKZF1缺失的远端子代细胞过继入NSG小鼠30天后，小鼠外周T细胞计数降低且Nalm6肿瘤控制减弱。总之，这些数据表明CAR T ACD介导子代细胞转录组程序差异，并赋予子代细胞不同的命运选择，IKZF1作为此过程远端子代细胞关键的转录因子维持细胞长寿命特征。

综上所述，这项研究通过LIPSTIC、蛋白质组-转录组-TCR scRNA-seq等手段，揭示非对称分裂引起CAR T细胞子代膜蛋白质组、转录组和代谢组的差异并进一步促进子代细胞命运的分化选择，为优化CAR T和其他基于T细胞的免疫治疗提供可操作的框架。

 

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